In silico дизайн ингибиторов протеинкиназы ск2 (работа) часть 3

11.07.2018

Анализ траекторий МД показал, что в целом соединения ИР7 и ИР9 имеют подобный тип связывания с СК2 (рис. 6, а б ). Они размещаются в АТФ-связывающий сайте СК2, взаимодействуют с гидрофобными остатками аминокислот C — и N-концевого доменов и образуют водородные связи с аминокислотными остатками Lys68 и Asp175. Для соединения ИР7 наблюдали еще один водородная связь между карбоксильной группе лиганда и г-карбоксильной группой Glu81.

Соединения ИР7 и ИР9 образуют гидрофобные контакты с рядом аминокислотных остатков АТФ-связывающего сайта СК2 (рис. 6, а б ). Контакты с остатками Phe113, Val66 и Ile174 являются ключевыми. Для соединения ИР9 наблюдали слабую гидрофобный взаимодействие с Phe113 по сравнению с составом ИР7 (рис. 6, б ).

iqoption-com.eu

Позиции лигандов в активном сайте СК2, рассчитанные программой DOCK и взятые как стартовые для расчета МД, почти идентичными для ИР7 и ИР9 (рис. 6, в ).

В

Рис. 7. Схематическое изображение влияния химических заместителей в позициях R 1 R 2 R < / B> 3 R 4 R 5 хинолонового ядра на биологическую активность 3-карбокси — 4 (1 Н ) — хинолонив

процессе МД такой тип связывания претерпевает определенные изменения. В течение первых 20 пс динамики, карбоксильная группа ингибитора ИР7, вращаясь, формирует дополнительную связь с Glu81, и до конца расчета МД наблюдали долговременные водородные связи с Lys68, Asp175 и Glu81. Напротив, ингибитор ИР9 смещается относительно начальной позиции в направлении шарнирной участка АТФ-связывающего сайта и теряет стэкинг-взаимодействие с остатком Phe113, но усиливает контакт хинолонового ядра и конденсированного по грани Н бензольного кольца с Leu45, Val53, Val66 и Ile174, сохраняя водородные связи с Lys68 и Asp175 (рис. 6, г ).

Анализ соотношения «химическая структура-биологическая активность" в ряду 3-карбокси-4 (1Н) — хинолонив. На основе данных биологического скрининга и предложенного нами типа связывания производных 4 (1 Н ) — хинолону с СК2 проанализировано влияние заместителей в химической структуре этих соединений на их биологическую активность (рис. 7). Важнейшим заместителем в структуре производных 4 (1 Н ) — хинолону является 3-карбоксигруппы. В отличие от производных с 3-карбоксигруппы, производные с 3-карбетоксигрупою имеют значительно более низкую активность. Согласно предложенному типа связывания это можно объяснить формированием стабильных водородных связей 3-карбоксигруппы с аминокислотными остатками АТФ-связывающего сайта — Lys68 и Asp175.

Значительное влияние на ингибирующее активность соединений имеет вариация заместителей в позициях R4 и R5 4 (1 Н ) — хинолону. Наибольшую активность проявляют соединения, которые в этих позициях имеют гидрофобные заместители. Вариация заместителей в позициях R2 и R3 4 (1 Н ) — хинолону меньше влияет на биологическую активность соединений, что объясняется незначительной взаимодействием заместителей в этом регионе АТФ-связывающего сайта с аминокислотными остатками.

Определение относительной энергии связывания новых ингибиторов СК2 методом термодинамического интеграции. Для расчета относительной свободной энергии новых ингибиторов СК2 — 3 карбокси — 4 (1 Н ) — хинолонив, а также для предсказания их более активных производных использован метод термодинамического интеграции (ТИ).

ТИ рассчитан как для ингибиторов с установленной нами активностью, так и для «виртуальных соединений», полученных за счет вариаций позиций атомов хлора в гетероцикл лиганда. Направление проведенных мутаций X & rarr; Y и результаты расчетов приведены в таблице 4.

Результаты расчетов ТИ показали, что повышение активности нового класса ингибиторов СК2 3-карбокси-4 (1 Н ) — хинолонив можно достичь через введения в их структуру дополнительных гидрофобных заместителей, например атомов хлора. Причем, такие группы должны локализоваться в благоприятных зонах активного сайта СК2 (позиции R5, R4, R3 гетероцикла). Очевидно, что эффект будет расти пропорционально величине гидрофобности заместителей, поэтому вероятно, что бромо — и йодо-замещенные производные 3-карбокси-4 (1 Н ) — хинолонив будут иметь большую активность, чем хлоропохидни. В процессе расчета ТИ IP7 & rarr; ИР9 для ИР9 показано изменение типа связки. При значении параметра л = 0,75 на 85 пс расчета стартовая позиция, которая отвечала рассчитанном типа связывания ингибитора ИР7, начинала меняться на отвечающую типа связывания ингибитора ИР9 (описано выше), и окончательно сформировалась в течение следующих значений л . Таким образом, полученные результаты расчета в целом подтверждают экспериментальные данные по биологической активности ингибиторов ИР7 и ИР9, а также еще раз указывают на существование различий в типах связывания ингибиторов ИР7 и ИР9.




Таблица 4

Направление проведенных мутаций

< b> и соответствующие значения K i и ДДF b

Х

ДДFb, кДж / моль-1

Y

ИР7

Ki = 0,06 мM

& rarr ;

11,45853

ИР9

Ki = 0,28 мM

< / TD>

ИР7

Ki = 0,06 мM

& rarr;

6,78941

ИР67

Ki = 0,48 мM

ИР7

Ki = 0,06 мM

& rarr;

6,83869

ИР55

Ki = 0,70 мM

ИР7

Ki = 0,06 мM

& rarr;

2,05721

Ирв

ИР7

Ki = 0,06 мM

& rarr;

-4,34568

ИРТ

ИР7

Ki = 0,06 мM

& rarr;

-0,28738

ИРТ2

ИР7

Ki = 0,06 мM

& rarr;

9,42026

ИРТ3

Поиск ингибиторов СК2 среди производных тетрагалогено-1,3-диоксо-2,3-дигидроизоиндолу. Для поиска новых ингибиторов CK2 проводили также рецептор-ориентированный виртуальный скрининг большой библиотеки низкомолекулярных органических соединений, которая насчитывала более 70 000 структур. Комбинаторная библиотека имела значительную диверсийнисть (разнообразие), поскольку состояла из многих химических классов. Среди соединений, отобранных по данным расчетов, оказались три походные тетрагалогено-1,3-диоксо-2,3-дигидроизоиндолу (TID) (рис. 8). Этот класс соединений ранее исследовался как ингибиторы CK2. Но по литературе известно, что галогенированные производные других классов соединений — бензотриазол и бензимидазола — являются селективными ингибиторами CK2. В связи с этим было решено тщательно изучить галогенированные 1,3-диоксо-2,3-дигидроизоиндолы.

Биологическое тестирование показало, что эти соединения значительно подавляют активность CK2. В табл. 5 приведены данные биологического тестирования для этого класса соединений. Как видно из таблицы, самым активным ингибитором является соединение 2.46 (IC50 = 0,15 мM).

R = Alk

Рис. 8 . Химическая с труктура тетрагалогено -1,3 — диоксо < b> -2,3 — ди  — гидроизоиндолив

Для исследования механизма действия найденных ингибиторов 2.43 и 2.46 проведения кинетические эксперименты при различных концентрациях ингибитора и АТФ, константы ингибирования составили 0,2 мM и 0,1 мM соответственно. Полученные данные указывают на то, что эти ингибиторы конкурируют с АТФ сайт связывания СК2.

Для проверки селективности действия найденных ингибиторов исследовано влияние соединений 2.43 , 2.45 , 2.46 и 2.58 на активность протеинкиназы DYRK1a, MSK1, GSK3 и CDK5. Результаты тестов показали, что эти соединения в концентрации 10 мM незначительно подавляют активность этих киназ.

A

Б

Таблица 5 < / p>

Химические структуры активных производных тетрагалогено-1,3-диоксо-2,3-дигидроизоиндолив и их значения IC 50

< COL WIDTH = 58>





Состав №

Структура

IC50, мM

Структура

IC50, мM

2.43

0,3

2.48

0,75

2.45 < / B>

1

2.58

0,6

2.46

0,15

2.59

1,5